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Reverse Festphasentransfektion von Proteinen und anderen Makromolekülen in lebende eukaryotische Zellen

Kurzfassung

Zellschonendes Universal-Tool zur Transfektion zahlreicher Molekül-Arten in alle gängigen Zellen und Zelllinien. Hochdurchsatzfähig durch automatisierbare Probenvorbereitung, einfache Lagerbedingungen und benutzerfreundliche Probenpräparation.

Hintergrund

Für Grundlagenforschung, Diagnostik und Therapie besteht der Bedarf an einer einfachen Methode zur Einbringung von Makromolekülen, wie z. B. Antikörper, in lebende eukaryotische Zellen. Die neue Methoden ermöglicht eine beschleunigte und kosteneffiziente Suche nach neuen Biopharmazeutika, die Identifikation von intrazellulären Wirkstofftargets, die Optimierung bereits bestehender Wirkstoffe sowie die Etablierung neuartiger zellulärer Assays.

Problemstellung

Für den Erfolg oder Misserfolg einer Transfektion entscheidend sind vor allem der verwendete Zelltyp und die Eigenschaften des einzuschleusenden Cargo-Moleküls. Etablierte Transfektionstechnologien gibt es für immortalisierte Zelllinien (z. B. HeLa oder CHO) sowie einige Primärzellen, aber immer in Kombination mit Nukleinsäuren, um so gezielt in die Genexpression der Zelle einzugreifen. Für alle anderen Molekülklassen hingegen gibt es derzeit genauso wenig Lösungen, wie für andere Zelltypen (Stammzellen, Immunzellen, neuronale Zellen sowie vollständig ausdifferenzierte Zellen).

Lösung

Am Forschungsinstitut BioQuant der Universität Heidelberg wurde eine neuartige Technologie der reversen Transfektion von Proteinen und anderen Makromolekülen in eukaryotische Zellen entwickelt. Die neue Methode, TOP-fase (Transfektion von Proteinen aus der Festphase) genannt, erlaubt die schonende Einschleusung ganz unterschiedlicher Klassen von Makromolekülen, funktionell aktive Proteine (z.B. Antiköper), Peptide, Metabolite oder membranimpermeable Wirkstoffe. Darüber hinaus können mit der erfindungsgemäßen Methode auch exotischere Cargos, wie exogene Organellen, molekulare Sonden oder Nanopartikel in die Zelle eingeschleust werden. TOP-fase steht hierbei für reverse Festphasen-Transfektionstechnologie, bei der Multiwell-Platten mit einer besonderen Komplexierung aus Cargo und Transfektionsreagenzien beschichtet werden. Hierbei werden die Moleküle, welche in lebender Zellen eingeführt werden sollen, mit Trägermolekülen komplexiert und mit Additiven sowie Beschichtungsmolekülen gemischt. Danach wird die Lösung auf die Oberfläche des Substratträgers aufgetragen und eintrocknen gelassen. Im „reversen“ Schritt werden erst am Schluss die lebenden Zellen auf dieses feste Substrat gegeben. Die Aufnahme der zu transportierenden Moleküle erfolgt mittels Endozytose und damit auf deutlich schonendere Weise als bei den herkömmlichen Methoden zum Einschleusen von Molekülen in Zellen. Das Funktionsprinzip von TOP-fase wurde wiederholt experimentell validiert und ist auf alle gängigen Zellen und Zelllinien anwendbar.

Festphasentransfektion in Multiwell-Platten und Zellarrays für DNA Knock-out durch CRISPR, Protein-Knock-down durch Antikörper oder Gene Silencing mittels RNAi. Pfeile: Zellkerne von Zellen im erwarteten Phänotyp (z. B. Zellzyklusstillstand) nach der Transfektion.
Festphasentransfektion in Multiwell-Platten und Zellarrays für DNA Knock-out durch CRISPR, Protein-Knock-down durch Antikörper oder Gene Silencing mittels RNAi. Pfeile: Zellkerne von Zellen im erwarteten Phänotyp (z. B. Zellzyklusstillstand) nach der Transfektion.

Vorteile

  • auf zahlreiche zu transportierende Moleküle anwendbar
  • für gängige Zellen und Zelllinien nutzbar
  • besonders zellschonend durch natürliche Aufnahmevorgang
  • einfache Probenpräparation und Umsetzung
  • hochdurchsatzfähig: problemlos automatisierbar und lange lagerfähig

Anwendungsbereiche

Von „Target Identification“ bis „Lead Optimisation“ im Target-based Drug Discovery, vom ersten Screen bis zur Target Deconvolution im Phenotypic Drug Discovery – die Vielfalt an Einsatzmöglichkeiten auf allen Stufen des Drug Discovery-Prozesses sind enorm. Mögliche Anwendungsgebiete sind beispielsweise Point-of-Care-Diagnostik, Protein-Knock-Downs oder Knock-Ins sowie die Bestimmung der Lokalisation intrazellulärer Proteine. 

Publikationen und Verweise

R. Bulkescher et al., Solid-phase reverse transfection for intracellular delivery of functionally active proteins, Genome Research, 2017

Exposé
Kontakt
Dr. Dirk Windisch
TLB GmbH
Ettlinger Straße 25
76137 Karlsruhe | Germany
Telefon +49 721-79004-0
windisch(at)tlb.de | www.tlb.de
Entwicklungsstand
TRL 4 – Technologie im Labor validiert
Patentsituation
EP2981616B1 erteilt
DE, FR,GB, LTU, EST, LVA validiert
Unionsmarke „TOP-fase“
EUTM 018024529 eingetragen
Referenznummer
13/017TLB
Service
Die Technologie-Lizenz-Büro GmbH ist mit der Verwertung der Technologie beauftragt und bietet Unternehmen die Möglichkeit der Lizenznahme.